Chỉnh sửa hệ gen bằng hệ thống CRISPR đối với vi khuần Agrobacterium spp.

 Chỉnh sửa hệ gen bằng hệ thống CRISPR đối với vi khuần Agrobacterium spp.

Nguồn: Savio D. Rodrigues,  Mansour Karimi,  Lennert Impens,  Els Van Lerberge,  Griet Coussens,  Stijn Aesaert, Debbie Rombaut,  Dominique Holtappels,  Heba M. M. Ibrahim,  Marc Van Montagu,  Jeroen Wagemans,  Thomas B. Jacobs,  Barbara De Coninck, and Laurens Pauwels. 2021. Efficient CRISPR-mediated base editing in Agrobacterium spp. PNAS January 12, 2021; vol. 118 (2) e2013338118

Agrobacteria là vi khuẩn ký sinh cây trồng mà chúng có thể vận chuyển phân tử DNA đến tế bào thực vật như là một công đoạn của chiến dịch xâm nhiễm. Bản chất này được áp dụng nhiều thập niên qua để tạo ra cây transgenic, gần đây nhất, chuyển gen được chỉnh sửa vào tế bào thực vật. Tầm cỡ quan trọng của chúng đối với nghiên cứu và công nghệ, các chủng nòi vi khuẩn phòng thí nghiệm vẫn chưa được cải tiến nhiều qua những năm nói trên, cũng như nhiều vấn đề sinh học của vi khuẩn Agrobacterium và sự phát sinh bệnh (pathogenesis) vẫn còn chưa rõ ràng. Người ta cố gắng phát triển một phương pháp tiếp cận mới: chỉnh sửa bằng CRISPR để cải biên hệ gen vi khuẩn Agrobacterium. Người ta quan sát những thay đổi nucleotide đơn có thể được du nhập vào vị trí đích cho cả hệ gen vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và Agrobacterium rhizogenes. Phân tích toàn hệ gen (whole-genome analysis) của những chủng nòi được cải biên ấy ghi nhận chỉ có một số lượng nhỏ nhất định các đột biến không mong muốn unintentional. Agrobacterium spp. là những pathogens quan trọng gây ra bệnh crown gall hoặc hairy root. Sự lây nhiễm độc đáo của chúng tùy thuộc vào cách vận chuyển một phần DNA của chúng vô tế bào thực vật. Nhờ khả năng tuyệt vời ấy, những phytopathogens trở thành công cụ sinh học có ích và cần thiết phục vụ công nghệ di truyền và công nghệ sinh học nông nghiệp. Mặc dù vi khuẩn Agrobacterium spp. là những công cụ chuẩn mực đối với các nhà nghiên cứu sinh học phân tử, những các chủng nòi vi khuẩn hiện nay ở nhiều phòng thí nghiệm vẫn chưa có những biến thể mới qua nhiều thập niên và phân tích chức năng của gen trong Agrobacterium vẫn còn nhiều khó khăn bởi chiến lược đột biến tự nhiên đòi hỏi nhiều thời gian. Do đó, người ta đã phát triển công  nghệ chỉnh sửa gen bằng hệ thống men  CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) để có đột biến điểm tại đích đến mong muốn vào genome vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và Agrobacterium rhizogenes. Người ta tạo ra được chủng nòi vi khuẩn EHA105 có đột biến kiẻu loss-of-function tại alen recA, mà gen này hoàn toàn có chức năng đối với chuyển nạp gen cho cây bắp (Zea mays), xác định được bản chất quan trọng của RolB and RolC để phát triển rễ tơ (hairy root) nhờ vi khuẩn A. rhizogenes K599. Phương pháp này có hiệu quả rất cao trong 9 thuộc 10 colonies sau chuyển nạp, chỉnh sửa được ít nhất 80% tế bào. Các hệ gen chủng nòi vi khuẩn EHA105 và K599 đã được chạy trình tự lại, phân tích đột biến không mong muốn trên toàn hệ gen được áp dụng để  nghiên cứu những chủng nòi chỉnh sửa gen sau khi chữa lỗi plasmid đóng vai trò base editor. Sự xuất hiện của những off-targets (đích đến không mong muốn) được định tính bằng kỹ thuật Cas9-independent off-targeting và point to TC motifs như hoạt động của những điểm nóng của men cytidine deaminase. Như vậy kỹ thuật CRISPR-mediated base editing đã khởi động được cái gọi là “engineering the engineer,” dẫn đến cải tiến chủng nòi vi khuẩn Agrobacterium để hiệu quả chuyển nạp gen cho cây trồng tốt hơn trong trường hợp chỉnh sửa hệ gen hiện nay trên toàn thế giới.  Xem: https://www.pnas.org/content/118/2/e2013338118